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Estudios In-Vitro

Índice:

Estudio in vitro

Estudio in vitro

Citotoxicidad en placas de 96 pocillos

Título

Evaluación del potencial citotóxico de un elemento de ensayo tras aplicación en células cultivadas en placas de 96 pocillos – Coloración del Rojo Neutro

Referencia

Adaptación de la técnica descrita por Mossman (Journ. Of Immunological Methods, 1983, 65, 55-63)

Objectivo

Evaluar cuantitativamente el potencial citotóxico de un elemento de ensayo soluble tras aplicación en células cultivadas en placas de 96 pocillos

Sist. de ensayo

Células de córnea de conejo SIRC

Planificación

Duración del estudio: 4 días

Inicio: 1 semana tras la recepción de la muestra

Informe: 2-3 semanas tras la finalización del estudio

Cantidad

2 x 20 g

Metodología

Determinación de la citotoxicidad tras contacto del elemento de ensayo con células mediante tinción de las células vivas con un colorante vital (Rojo Neutro). Cálculo del porcentaje de mortalidad celular y de la CI50 o concentración del elemento de ensayo para la cual se obtiene un 50% de mortalidad celular

Procedimiento

D-1:

  • Cultivo de células

D1:

  • Contacto de las diluciones del elemento de ensayo (8) con las células
  • Exposición UV

D3:

  • Preparación de la solución colorante y de la solución reveladora
  • Revelación de la citotoxicidad
  • Lectura

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Citotoxicidad extracto – ISO 10993-5

Título

Evaluación del potencial citotóxico de un extracto de un elemento de ensayo (producto sanitario)

Referencia

ISO 10993-5 (Junio 2009) e ISO 10993-12 (Diciembre 2009))

Objectivo

Evaluar cuantitativamente el potencial citotóxico de un elemento de ensayo soluble tras aplicación en células cultivadas en placas de 96 pocillos

Sist. de ensayo

Fibroblastos de pulmón de ratón – NCTC L929

Planificación

Duración del estudio: 3 días

Inicio: 1 semana tras la recepción de la muestra

Informe: 2-3 semanas tras la finalización del estudio

Cantidad

A definir según el tipo de elemento de ensayo

Metodología

Determinación de la citotoxicidad tras contacto del extracto del elemento de ensayo y sus diluciones con células, mediante tinción de células vivas con un colorante vital (Rojo Neutro). Cálculo de los porcentajes de mortalidad celular y viabilidad celular (evaluación cuantitativa) y apreciación del aspecto morfológico de las células (evaluación cualitativa)

Procedimiento

D-1:

  • Cultivo de células
  • Preparación del extracto

D1:

  • Contacto del extracto y sus diluciones con las células
  • Incubación durante 24/72 horas

D2:

  • Preparación de la solución colorante
  • Preparación de la solución reveladora
  • Revelación de la citotoxicidad

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Citotoxicidad contacto directo– ISO 10993-5

Título

Evaluación del potencial citotóxico de un elemento de ensayo (producto sanitario) tras contacto directo

Referencia

ISO 10993-5 (Junio 2009) e ISO 10993-12 (Diciembre 2009)

Objectivo

Evaluar cuantitativa y cualitativamente el potencial citotóxico de un elemento de ensayo tras contacto directo con células cultivadas en placas de 96 pocillos

Sist. de ensayo

Fibroblastos de pulmón de ratón – NCTC L929

Planificación

Duración del estudio: 3 días

Inicio: 1 semana tras la recepción de la muestra

Informe: 2-3 semanas tras la finalización del estudio

Cantidad

 A definir según el tipo de producto sanitario

Metodología

Determinación de la citotoxicidad tras contacto directo del elemento de ensayo con células, mediante tinción de células vivas con un colorante vital (Rojo Neutro). Cálculo del porcentaje de mortalidad y viabilidad celular (evaluación cuantitativa) y apreciación del aspecto morfológico de las células (evaluación cualitativa)

Procedimiento

D-1:

  • Cultivo de células

D1:

  • Contacto del elemento de ensayo
  • Incubación durante 24 horas

D2:

  • Preparación de la solución colorante y de la solución reveladora
  • Revelación de la citotoxicidad
  • Lectura

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Citotoxicidad contacto indirecto– ISO 10993-5

Título

Evaluación del potencial citotóxico de un elemento de ensayo (producto sanitario) tras contacto indirecto

Referencia

 

ISO 10993-5 (Junio 2009) e ISO 10993-12 (Diciembre 2009)

Objectivo

Evaluar cuantitativa y cualitativamente el potencial citotóxico de un elemento de ensayo tras contacto indirecto con la superficie de un gel de agarosa en contacto con las células

Sist. de ensayo

Fibroblastos de pulmón de ratón – NCTC L929

Planificación

Duración del estudio: 3 días

Inicio: 1 semana tras la recepción de la muestra

Informe: 2-3 semanas tras la finalización del estudio

Cantidad

 A definir según el tipo de producto sanitario

Metodología

Determinación de la citotoxicidad tras contacto del elemento de ensayo con la superficie de un gel de agarosa en contacto con células, mediante la tinción de células vivas con un colorante vital (Rojo Neutro). Cálculo del diámetro del área de lisis celular (evaluación cuantitativa) y apreciación del aspecto morfológico de las células (evaluación cualitativa)

Procedimiento

D-1:

  • Cultivo de células

D1:

  • Preparación del gel de agarosa
  • Contacto del gel de agarosa con las células
  • Contacto del elemento de ensayo
  • Incubación durante 24 horas

D2:

  • Preparación de la solución colorante
  • Revelación de la citotoxicidad
  • Lectura

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Agarosa

Título

Evaluación del potencial irritante de un elemento de ensayo mediante determinación de la citotoxicidad tras difusión en gel de agarosa

Referencia

Adaptación de Combrier E. y Castelli D. («the Agarose Overlay method as a screening approach for ocular irritancy: Application to cosmetic products» Atla. 20, 438-444, 1992). Publicado en el Diario Oficial de la República Francesa del 30 de diciembre de 1999.

Objectivo

Evaluar cuantitativamente la citotoxicidad de un elemento de ensayo

Sist. de ensayo

Fibroblastos de pulmón de ratón – NCTC L929

Planificación

Duración del estudio: 3 días

Inicio: 1 semana tras la recepción de la muestra

Informe: 2-3 semanas tras la finalización del estudio

Cantidad

2 x 20 g

Metodología

Determinación de la citotoxicidad mediante la apreciación del diámetro medio del área de lisis celular revelada mediante la tinción de células vivas con un colorante vital (MTT) tras la aplicación durante 24 h del elemento de ensayo en la superficie de un gel de agarosa en contacto con células

Procedimiento

D-1:

  • Cultivo de células

D1:

  • Preparación del gel de agarosa y el elemento de ensayo
  • Contacto del gel con las células
  • Aplicación del elemento de ensayo

D2:

  • Revelación de la citotoxicidad
  • Lectura

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NRR

Título

Evaluación del potencial irritante de un elemento de ensayo por aplicación directa en fibroblastos de córnea de conejo, mediante el método de liberación del rojo neutro

Referencia

Adaptación de la técnica descrita por Reader (Tox. In Vitro, 1990, 4, 264-266).

Publicado en el Diario Oficial de la República Francesa del 30 de diciembre de 1999.

Objectivo

Evaluar cuantitativamente la citotoxicidad de un elemento de ensayo

Sist. de ensayo

Fibroblastos de córnea de conejo - SIRC

Planificación

Duración del estudio: 2 días

Inicio: 1 semana tras la recepción de la muestra

Informe: 2-3 semanas tras la finalización del estudio

Cantidad

2 x 20 g

Metodología

Determinación de la citotoxicidad tras contacto del elemento de ensayo con una monocapa de células marcadas con un colorante vital (Rojo Neutro). Determinación de la CI50 o concentración del elemento de ensayo que inhibe el 50% de la supervivencia y el crecimiento celular

Procedimiento

D-1:

  • Cultivo de células

D1:

  • Tinción de células
  • Contacto con las diluciones del elemento de ensayo
  • Revelación de la citotoxicidad
  • Lectura

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RBC

Título

Evaluación del potencial irritante de un elemento de ensayo mediante la determinación de su poder hemolítico y desnaturalizante frente a las proteínas (Ensayo de Red Blood Cells)

Referencia

Adaptación de la técnica descrita por Pape (IN VITTOX, study plan n° 37, Red Blood Cell Test System) (IP 37 Enero 1992).

Objectivo

Evaluar el potencial irritante de un elemento de ensayo que contiene tensioactivos

Sist. de ensayo

Hematíes de oveja

Planificación

Duración del estudio: 1 día

Inicio: 1 semana tras la recepción de la muestra

Informe: 2-3 semanas tras la finalización del estudio

Cantidad

2 x 20 g

Metodología

Determinación de la cantidad de hemoglobina liberada (oxihemoglobina) y de las proteínas desnaturalizadas en el sobrenadante mediante espectrofotometría (VISIONliteTM software). Cálculo de la concentración del elemento de ensayo que induce un 50% de lisis celular (H50).

Cálculo del índice de desnaturalización (ID) frente a la desnaturalización observada con una solución de dodecil sulfato sódico. Cálculo de la relación H50/ID y correlación con el potencial irritante ocular del elemento de ensayo en función de una escala de clasificación establecida.

Procedimiento

 • Test de hemólisis:

- contacto del elemento de ensayo con los hematíes

- dosificación de la liberación de hemoglobina

• Test de desnaturalización de proteínas:

- dosificación de las proteínas desnaturalizadas

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HET CAM

Título

Evaluación del potencial irritante de un elemento de ensayo tras aplicación sobre la membrana corioalantoidea del huevo de gallina embrionado

Referencia

Adaptación de la técnica descrita por Luepke N.P. y Kemper F.H. (The Het-Cam test: “An alternative to the Draize eye test”. Food Chem. Toxicol. 1986, 24, n° 6/7, 495-496). Publicado en el Diario Oficial de la República Francesa del 26 de diciembre de 1996.

Objectivo

Evaluar semi-cuantitativamente el potencial irritante de un elemento de ensayo

Sist. de ensayo

Huevos de gallina embrionados de origen White Leghorn

Planificación

Duración del estudio: 1 día

Inicio: 1 semana tras la recepción de la muestra

Informe: 2-3 semanas tras la finalización del estudio

Cantidad

2 x 20 g

Metodología

Observación de los efectos irritantes (hiperemia, hemorragia y coagulación) que pueden surgir tras aplicación del elemento de ensayo en la membrana corioalantoidea del huevo de gallina embrionado (MCA) en el 10º día de incubación

Procedimiento

Preparación de los huevos y del elemento de ensayo

Aplicación del elemento de ensayo

Lecturas

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BCOP

Título

Evaluación del potencial irritante de un elemento de ensayo tras su aplicación sobre córnea bovina aislada

Referencia

Adaptación de la técnica descrita por Gautheron P. et al (Fundam. Appl. Toxicol. 1992, 18, 442-449).

Objectivo

Evaluar semi-cuantitativamente el potencial irritante de un elemento de ensayo

Sist. de ensayo

Córneas bovinas

Planificación

Duración del estudio: 2 días

Inicio: 1 semana tras la recepción de la muestra

Informe: 2-3 semanas tras la finalización del estudio

Cantidad

2 x 30 g

Metodología

Medir la opacidad y permeabilidad de la córnea bovina a la fluoresceína tras contacto con el elemento de ensayo para uno o varios tiempos definidos

Procedimiento

Montaje de las córneas antes de la incubación

Medida de la opacidad a T0

Contacto con el elemento de ensayo (2)

Medida de la opacidad después del contacto

Medida de la permeabilidad

Evaluación del daño corneal

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BCOP - OCDE 437

Título

Método de ensayo de opacidad y permeabilidad de la córnea bovina mediante la identificación de sustancias corrosivas y fuertemente irritantes para el ojo - OCDE 437

Referencia

Adaptación de la técnica descrita por Gautheron P. et al (Fundam. Appl. Toxicol. 1992, 18, 442-449). Basado en el protocolo de BCOP del Comité de Coordinación entre-agencias para la Validación de Métodos Alternativos (ICCVAM) del 2007, el Protocolo nº 124 INVITTOX del 1999 y las informaciones suministradas por el Institute for In Vitro Sciences (IIVS)

Objectivo

Identificar las sustancias corrosivas y fuertemente irritantes para el ojo (clase R41)

Sist. de ensayo

Córneas bovinas

Planificación

Duración del estudio: 1 día

Inicio: 1 semana tras la recepción de la muestra

Informe: 2-3 semanas tras la finalización del estudio

Cantidad

2 x 30 g

Metodología

Medir la opacidad y permeabilidad de la córnea bovina a la fluoresceína, tras contacto con el elemento de ensayo, bajo condiciones experimentales definidas de acuerdo con la naturaleza organoléptica del producto

Procedimiento

Montaje de las córneas antes de la incubación

Medida de la opacidad a T0

Contacto con el elemento de ensayo

Medida de la opacidad tras el contacto

Medida de la permeabilidad

Evaluación del daño corneal

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Irritación cutánea

Título

Evaluación del potencial irritante de un elemento de ensayo sobre un modelo de epidermis reconstituida - EPISKINTM – OCDE 439

Referencia

Método aprobado por el ECVAM (European Centre for the Validation of Alternatives Methods) y por COLIPA (European Cosmetic Toiletry and Perfumery Industry Association): ATLA, 35, 559-619, 2007.

Objectivo

Evaluar cuantitativamente la capacidad del elemento de ensayo para producir una disminución de la viabilidad celular al penetrar el estrato córneo, tras un contacto de 15 minutos con la epidermis reconstituida

Sist. de ensayo

EPISKINTM con queratinocitos de estrato córneo humano (3 unidades de epidermis)

Planificación

Duración del estudio: 4 días

Inicio: 4 semanas tras la recepción de la muestra

Informe: 2-3 semanas tras la finalización del estudio

Cantidad

 2 x 20 g

Metodología

Evaluación del porcentaje de viabilidad celular mediante tinción de células vivas con un colorante vital (MTT). Medida de la actividad mitocondrial y lectura de las densidades ópticas

Procedimiento

Para cada lote de epidermis reconstruida:

D-1:

  • Control y almacenaje de los sistemas de ensayo a la recepción

D1:

  • Preparación de la epidermis reconstruida
  • Contacto con el elemento de ensayo (15 minutos)
  • Incubación durante 42 horas

D3:

  • Revelación de la citotoxicidad
  • Incubación durante 3 horas
  • Lectura

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Corrosividad cutánea

Título

Evaluación de la corrosividad cutánea tras aplicación de un elemento de ensayo en un modelo de epidermis reconstruida – OCDE 431

Referencia

Método aprobado por la Comisión Europea y sus comités consultativos (SCCNFP…) y por el ESAC (the ECVAM Scientific advisory committee) - (03/04/1998). Validado por el ECVAM (European Centre for the Validation of Alternatives Methods) y por COLIPA (European Cosmetic Toiletry and Perfumery Industry Association): ATLA, 23, 291-355, 1995. Publicado en la Directiva 67/548/EEC relativa a la clasificación de las sustancias peligrosas (4 de febrero de 2000): Método B-40- anexo V – distinción entre sustancia no corrosiva y R34 y R35.

Objectivo

Evaluar cuantitativamente la capacidad del elemento de ensayo para producir una disminución de la viabilidad celular al penetrar el estrato córneo mediante difusión o erosión tras diferentes tiempos de contacto

Sist. de ensayo

EPISKINTM con queratinocitos de estrato córneo humano (3 lotes – 1/semana)

Planificación

Duración del estudio: 3 semanas

Inicio: 4 semanas tras la recepción de la muestra

Informe: 2-3 semanas tras la finalización del estudio

Cantidad

 2 x 20 g

Metodología

Evaluación de la viabilidad celular mediante tinción de células vivas con un colorante vital (MTT). Medida de la actividad mitocondrial y lectura de las densidades ópticas

Procedimiento

Para cada lote de epidermis reconstruida:

D-1:

  • Control e incubación del sistema de estudio a la recepción

D1:

  • Preparación de la epidermis reconstruida (1/tiempo de contacto)
  • Contacto del elemento de ensayo (3 minutos – 1 hora – 4 horas)
  • Aclarado de los sistemas de estudio
  • Revelación de la citotoxicidad

D2:

  • Lectura

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Foto-citotoxicidad

Título

Evaluación del potencial fototóxico de un elemento de ensayo soluble – Test de fotocitotoxicidad in vitro 3T3 NRU – OCDE 432

Referencia

Método aprobado por la Comisión Europea y sus comités consultativos (SCCNFP…) y por el ESAC (the ECVAM Scientific advisory committee) el 3 de noviembre de 1997. Validado por el ECVAM (European Centre for the Validation of Alternatives Methods) y por COLIPA (European Cosmetic Toiletry and Perfumery Industry Association): Toxicology in vitro, 12, 305-327, 1998. Application to UV filters: ATLA, 26, 679-708, 1998. Publicado en la Directiva 67/548/EEC relativa a la clasificación de sustancias peligrosas (4 de febrero de 2000): Método B-41- anexo V

Objectivo

Evaluar cuantitativamente el potencial fototóxico de un elemento de ensayo soluble tras exposición a los rayos UV

Sist. de ensayo

Fibroblastos de ratón Balbc 3T3, clone A31

Planificación

Duración del estudio: 3 días

Inicio: 1 semana tras la recepción de la muestra

Informe: 2-3 semanas tras la finalización del estudio

Cantidad

2 x 20 g

Metodología

Comparación de la citotoxicidad de un elemento de ensayo al probarse en presencia o en ausencia de exposición a una dosis no citotóxica de radiación UV artificial (Sol 500 – Dr Hönle). Determinación de la viabilidad celular mediante la incorporación de un colorante vital (Rojo Neutro) y apreciación del factor de foto-irritación y/o foto efecto medio

Procedimiento

D-1:

  • Cultivo de células

D1:

  • Contacto de las diluciones del elemento de ensayo (8) con las células
  • Exposición UV

D2:

  • Preparación de la solución colorante y de la solución reveladora
  • Revelación de la citotoxicidad
  • Lectura

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